Enzyme de restriction

Une enzyme de restriction est une protéine en biologie moléculaire qui peut couper un fragment d'ADN au niveau d'une séquence de nucléotides caractéristique nommée site de restriction. Chaque enzyme de restriction reconnait ainsi un site spécifique. Plusieurs centaines d'enzymes de restriction sont aujourd'hui connues, on en retrouve naturellement dans la plupart d'espèces de bactéries.

Ces enzymes, naturellement présentes chez les bactéries, sont devenues des outils indispensables en génie génétique.

Rôle biologique

Les enzymes de restriction sont produites par des bactéries et forment un mécanisme de défense contre les infections par les bactériophages, des virus spécifiques des bactéries. Quand le virus injecte son ADN dans le micro-organisme, ce dernier est coupé par l'enzyme de restriction au niveau de ses sites spécifiques. La destruction du génome du virus bloque ainsi l'infection. Le nom d'enzyme de restriction provient de ce mécanisme, en effet la présence de ces enzymes dans les bactéries restreint l'infectiosité des bactériophages.

Pour éviter que l'enzyme de restriction ne coupe l'ADN de son propre génome, la bactérie produit aussi une deuxième enzyme nommée méthylase qui reconnaît aussi le site de restriction. La méthylase ne coupe pas l'ADN, mais le modifie en lui rajoutant un groupement méthyle sur un ou plusieurs nucléotides du site. Cette méthylation empêche la coupure par l'enzyme de restriction.

Ce mécanisme de défense, nommé dispositif de restriction/modification, associe toujours ces deux enzymes, l'une de coupure et l'autre de protection.

Propriétés

Les enzymes de restrictions appartiennent à la classe des endonucléases, c'est-à-dire des enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides au sein de la chaîne d'un acide nucléique. Les endonucléases changent des exonucléases, dans la mesure où elles peuvent cliver les brins d'ADN de manière interne, tandis que les exonucléases n'attaquent la molécule d'ADN qu'au niveau de ses extrémités.

Les enzymes de restriction sont capables de reconnaître particulièrement une courte séquence de l'ADN de 4 à 10 paires de bases, et de cliver les deux brins du duplex d'ADN au site reconnu. Cette propriété a depuis longtemps été utilisée en biologie moléculaire, dans la mesure où elles permettent de fragmenter l'ADN en segments de taille réduite en coupant à des sites définis.

Les enzymes de restriction peuvent être utilisées pour établir une carte génétique (appelée "carte de restriction") d'une molécule d'ADN. La carte de restriction donne l'ordre des sites de restriction le long de cette molécule, et la taille des fragments produits. Cette technique de caractérisation des acides nucléiques, particulièrement utilisée voici une vingtaine d'années, est supplantée par le séquençage direct, devenu bien moins coûteux et réalisé de façon routinière.

Selon la relation spatiale entre la séquence reconnue et le lieu de coupure, il est envisageable de distinguer trois types d'enzymes de restriction. Les enzymes de type I et de type III reconnaissent une séquence d'ADN spécifique et coupent en un lieu aléatoire, d'une distance d'environ 1OOO paires de bases (bp) pour le type I et de 25 bp pour le type III plus loin que le site de restriction. Ces 2 types ont aussi une activité méthylasique en plus de leur activité endonucléasique, ce qui les différencient du type II. Les enzymes de type II, les plus utilisées, reconnaissent une séquence spécifique et coupent en un lieu spécifique de cette séquence. Quelques exemples de ces enzymes figurent ci-dessous.

Généralement, les enzymes de restriction sont bloquées par le monoazide d'éthidium.

Exemples d'enzymes de type II

Enzyme	Source	Sequence reconnue	Coupure
Eco RI	Escherichia coli	5'GAATTC 3'CTTAAG	5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5'
BamHI	Bacillus amyloliquefaciens	5'GGATCC 3'CCTAGG	5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5'
HindIII	Hæmophilus influenzæ	5'AAGCTT 3'TTCGAA	5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5'
MstII	Microcoleus species	5'CCTNAGG 3'GGAMTCC	5'---CC TNAGG---3' 3'---GGAMT CC---5'
TaqI	Thermus aquaticus	5'TCGA 3'AGCT	5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5'
NotI	Nocardia otitidis	5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG
HinfI	Hæmophilus influenzæ	5'GANTC 3'CTNAG
AluI	Arthrobacter luteus	5'AGCT 3'TCGA	5'---AG CT---3' 3'---TC GA---5'
BgIIII	Bacillus globigi	5'AGATCT 3'TCTAGA	5'---A GATCT---3' 3'---TCTAG A---5'
HæIII	Hæmophilus ægyptius	5'GGCC 3'CCGG	5'---GG CC---3' 3'---CC GG---5'
HhaI	Hæmophilus hæmolyticus	5'GCGC 3'CGCG	5'---GCG C---3' 3'---C GCG---5'
PstI	Providencia stuartii	5'CTGCAG 3'GACGTC	5'---CTGCA G---3' 3'---G ACGTC---5'
SmaI	Serratia marcescens	5'CCCGGG 3'GGGCCC	5'---CCC GGG---3' 3'---GGG CCC---5'

Le N et le M dans la séquence de MstII peuvent être remplacés par une des 4 bases et son complément. La séquence de restriction du MstII est un exemple de palindrome imparfait dans la mesure où il comporte un nombre impair de paires de bases. Le nom de l'enzyme provient du nom de la bactérie qui les produisent, quelquefois suivit d'une lettre selon la souche de laquelle elles dérivent (le R de Eco RI) et le chiffre correspond à l'ordre dans lequel on les découvrent.

Utilisations

Les digestions enzymatiques se font le plus souvent dans un microtube mis au bain-marie à température convenablement réglé (généralement 37°C) sur un portoir flottant.

Voir aussi

• Sites de restriction
• Werner Arber

Liens externes

• (en) REBASE - Base de données des enzymes de restriction
• (en) Restriction enzyme finder - Identification de sites de restriction dans une séquence

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